Klonierungskette bei Mäusen endet nach 58 Generationen, während sich schädliche DNA-Veränderungen anhäufen

Ein 20-jähriges Experiment stößt an seine Grenzen

Nach 30.947 Kerntransfer-Versuchen und mehr als 1.200 Mäusen, die durch Klonen von einem einzigen Weibchen abstammten, erreichte ein japanisches Forschungsteam das Ende eines rund 20 Jahre dauernden Experiments. Die fünf Mäuse, die in der 58. Generation geboren wurden, starben alle am folgenden Tag. Damit endete eine Kette, von der Forschende einst glaubten, sie könne unbegrenzt weitergehen.

Das von 2005 bis 2025 durchgeführte Experiment ergab, dass sich durch wiederholtes Klonen schädliche Veränderungen in der DNA anhäuften. Die Erfolgsrate bei den Geburten stieg zunächst von etwa 7 % in der ersten Generation auf 15,5 % in der 26. Generation. Ab der 27. Generation ging sie zurück und erreichte schließlich 0,6 % – etwa sechs Geburten je 1.000 geklonte Embryonen, die auf Leihmütter übertragen wurden.

Die Ergebnisse wurden in Limitations of serial cloning veröffentlicht, einer Studie in Nature Communications. Die Universität Yamanashi nannte in ihrer Forschungsmitteilung die außerordentliche Professorin Sayaka Wakayama und den Professor Teruhiko Wakayama, Direktor ihres Zentrums für fortgeschrittene Biotechnologie, als Forschende.

Besonders aufschlussreich war der Gegensatz zwischen Aussehen und Fortpflanzungsfähigkeit. Viele Mäuse in der Kette wirkten gesund und lebten etwa zwei Jahre. Spätere Generationen ließen sich jedoch zunehmend schwerer fortpflanzen – sowohl durch Klonen als auch auf natürlichem Weg.

Teruhiko Wakayama, ein Pionier des Klonens von Mäusen an der Universität Yamanashi, beschrieb die Frage hinter dem Experiment mit einem anschaulichen Vergleich:

Wenn man ein Bild mit einem Fotokopierer kopiert, ist die Bildqualität etwas schlechter. Kopiert man diese Kopie noch einmal, verschlechtert sich die Qualität weiter.

Bei den Mäusen betrafen die Veränderungen sowohl einzelne DNA-Bausteine als auch deutlich größere Abschnitte der Chromosomen. Die Studie bringt diese sich anhäufenden Veränderungen mit dem späteren Einbruch der erfolgreichen Geburten in Verbindung.

Wie Forschende einen Klon klonten

Das Team nutzte den somatischen Zellkerntransfer. Eine somatische Zelle ist eine Körperzelle, also keine Ei- oder Samenzelle. Die Forschenden entnahmen den Zellkern, der den Großteil der Erbinformation einer Zelle enthält, und übertrugen ihn in eine unbefruchtete Eizelle, deren eigener Zellkern zuvor entfernt worden war.

Anschließend musste die Eizelle die Erbinformation so zurücksetzen, dass ein Zellkern aus einer erwachsenen Körperzelle die Entwicklung eines Embryos steuern konnte. Die Forschenden übertrugen die entstandenen Embryonen auf Leihmütter und nutzten Zellen der überlebenden Klone, um die nächste Generation zu erzeugen.

Die Spenderzellen stammten von Cumuluszellen, die Eizellen umgeben und unterstützen. Die ursprüngliche Spenderin war eine Maus mit Agouti-Fell, dessen Färbung durch Pigmentbänder auf den einzelnen Haaren entsteht. Alle geklonten Mäuse waren weiblich und hatten diese Fellfarbe.

Die Forschenden erzeugten etwa drei bis vier Generationen pro Jahr. Statt jede Maus direkt aus den eingelagerten Zellen der ursprünglichen Spenderin zu erzeugen, führten sie die Linie wiederholt über ein neu geklontes Tier weiter. So konnten sie verfolgen, welche Veränderungen von einer Generation zur nächsten weitergegeben wurden.

Warum die frühen Ergebnisse vielversprechend wirkten

In einer Mitteilung vom März 2013 beschrieb RIKEN ein Experiment, dessen Entwicklung noch ermutigend schien. Bis zur Einreichung der Studie hatte das Team 581 Mäuse über 25 Generationen erzeugt; zum Zeitpunkt der Mitteilung waren es 598 Mäuse über 26 Generationen.

Die Forschenden verwendeten Trichostatin A, kurz TSA, ein Medikament, das dem übertragenen Zellkern hilft, seine Genaktivität zurückzusetzen. Frühere Versuche, Mäuse wiederholt zu klonen, waren nur über etwa sechs Generationen gelungen. Mit TSA und verbesserten Versuchsbedingungen stieg die Erfolgsrate bei den Geburten, statt kontinuierlich zu sinken.

Auch Messwerte zu Gesundheit, Fruchtbarkeit, Lebensdauer und Chromosomenenden wirkten zu diesem Zeitpunkt beruhigend. Die Forschenden glaubten daher, dass der Prozess unbegrenzt weitergehen könnte. Die Fortführung derselben Linie über ein weiteres Jahrzehnt brachte Probleme ans Licht, die in den ersten 25 Generationen nicht erkennbar gewesen waren.

Die wichtigsten Meilensteine zeigen, wie sich die Schlussfolgerung änderte:

• 2005: Das serielle Klonen begann. Die abschließende Studie datiert den Beginn auf Januar, während RIKENs Bericht von 2013 das Jahresende nennt.
• 8. März 2013: RIKEN meldete 598 Mäuse über 26 Generationen; die Erfolgsrate bei den Geburten hatte rund 15 % erreicht.
• Ab der 27. Generation: Die Erfolgsrate bei den Geburten begann dauerhaft zu sinken, trotz Schwankungen zwischen einzelnen Generationen.
• 2025: Das Experiment endete nach der 58. Generation, nachdem alle fünf in dieser Generation geborenen Mäuse am folgenden Tag gestorben waren.

Was veränderte sich in der DNA?

Die Genomsequenzierung ergab zwischen der ersten und der 57. Generation etwa 3.700 Einzelnukleotidvarianten und 80 kleine Einfügungen oder Verluste von DNA-Abschnitten. Eine Einzelnukleotidvariante (SNV) ist eine Veränderung eines einzelnen Buchstabens in der DNA-Sequenz. Bei einer Einfügung oder einem Verlust wird ein kurzer Abschnitt dieser Sequenz hinzugefügt oder entfernt.

Der Studie zufolge traten pro Generation durchschnittlich 69,4 SNVs und 1,4 kleine Einfügungen oder Verluste auf. Viele DNA-Veränderungen haben kaum Auswirkungen, manche stören jedoch die Erbinformation, die für eine normale Entwicklung oder Fortpflanzung erforderlich ist.

Zum Vergleich untersuchten die Forschenden zwei Mauslinien, die über 60 Generationen hinweg durch Verpaarung von Geschwistertieren und über einen Zeitraum von etwa 20 Jahren weitergeführt worden waren. Diese Linien sammelten durchschnittlich 22,3 SNVs pro Generation an. Die Rate in der Klonierungslinie war damit etwa 3,1-mal so hoch, ausgehend von 69,4 gegenüber 22,3.

Auch der Anteil kleiner Varianten, denen eine störende oder verändernde Wirkung auf Proteine vorhergesagt wurde, nahm zu. Er stieg von 0,52 % bei Veränderungen, die zwischen der ersten und der 23. Generation entstanden, auf 1,19 % bei Veränderungen zwischen der 23. und der 57. Generation.

Außerdem rekonstruierten die Forschenden anhand der DNA den Stammbaum der Mäuse. Er stimmte mit der dokumentierten Versuchslinie überein und bestätigte, dass die Kette während des gesamten Experiments von der ursprünglichen Spenderin abstammte.

Größere Chromosomenveränderungen erhöhten die Belastung

Bei den Mäusen häuften sich nicht nur Veränderungen einzelner DNA-Bausteine an. Die Sequenzierung identifizierte zwischen der ersten und der 57. Generation etwa 80 bis 84 neue strukturelle Varianten. Damit sind größere Veränderungen der Anordnung oder Menge von DNA gemeint.

Sechzehn größere Varianten betrafen Abschnitte von mindestens 40.000 DNA-Bausteinen. Zu den Veränderungen zählten der Verlust eines X-Chromosoms, eine größere Veränderung auf Chromosom vier und ein Austausch von Erbmaterial zwischen den Chromosomen sieben und neun.

Für die 57. Generation schätzten die Forschenden, dass rund 30 Mutationen zum Verlust der Genfunktion führten und etwa 50 die in Genen codierten Proteininformationen veränderten – noch bevor der Verlust eines X-Chromosoms berücksichtigt wurde. Zwei größere Deletionen betrafen außerdem dieselbe Region und führten dazu, dass beide Kopien eines Gens namens Csmd1 ihre Funktion verloren.

Die Autorinnen und Autoren bringen die sinkende Geburtenrate mit der Gesamtbelastung durch Mutationen in Verbindung. Ihrer Erklärung zufolge führten weitere schädliche Veränderungen gegen Ende des Experiments dazu, dass das bereits stark veränderte Genom die Belastbarkeit der sich entwickelnden Mäuse überstieg.

Warum die Mutationsrate höher war, ist noch ungeklärt. Wiederholte Übertragungen von Zellkernen aus Körperzellen könnten dazu beitragen; außerdem können Körperzellen im Laufe des Lebens eines Tieres Mutationen ansammeln. Dass die gewöhnliche geschlechtliche Fortpflanzung ausblieb, veränderte ebenfalls, wie diese Mutationen über Generationen weitergegeben wurden.

Warum das Zurücksetzen der Genaktivität nicht ausreichte

Klonen erfordert mehr, als DNA in eine Eizelle zu übertragen. Die Eizelle muss auch chemische Markierungen zurücksetzen, die mitbestimmen, welche Gene aktiv sind. Diese Markierungen werden als epigenetisch bezeichnet, weil sie die Nutzung der DNA regulieren, ohne deren Sequenz zu verändern.

Die Forschenden hatten vermutet, dass Fehler beim Zurücksetzen mit jeder Klonierungsrunde zunehmen könnten. Ihre Messungen deuteten stattdessen darauf hin, dass sich vor allem DNA-Mutationen anhäuften und den späteren Rückgang erklärten.

Die geklonten Mäuse hatten vergrößerte Plazenten, ein bekanntes Merkmal des Klonens bei Mäusen. Über das gesamte Experiment hinweg wogen die Plazenten durchschnittlich etwa 0,30 Gramm, verglichen mit 0,11 Gramm bei Kontrolltieren, die durch In-vitro-Fertilisation entstanden waren. Ihr Gewicht nahm jedoch nicht mit jeder weiteren Generation zu.

Untersuchungen mehrerer epigenetischer Markierungen in frühen Embryonen zeigten außerdem weitgehend ähnliche Muster bei neu erzeugten Klonen und Klonen der 51. Generation. TSA half weiterhin: Die Erfolgsrate bei den Geburten in der 51. Generation lag mit Behandlung bei 5,4 %, ohne Behandlung bei 1,6 %.

Telomere, die schützenden DNA-Sequenzen an den Enden der Chromosomen, kamen als weitere mögliche Erklärung infrage. Die späteren Sequenzierungsanalysen fanden jedoch kaum Hinweise auf eine deutliche Verkürzung über die untersuchten Generationen hinweg. Zusammengenommen lenkten die Tests den Blick auf die zunehmende Belastung durch Veränderungen der DNA-Sequenz und der Chromosomenstruktur.

Gesund wirkende Mäuse bekamen weniger Nachwuchs

Bei der gewöhnlichen Fortpflanzung zeigte sich ein Rückgang der Fruchtbarkeit, der anhand des Aussehens der Mäuse leicht zu übersehen war. Weibchen der 20. Generation bekamen bei der Paarung mit normalen Männchen durchschnittlich 9,9 Junge pro Wurf. Das lag nahe am Kontrollwert von 10,3.

Die durchschnittliche Wurfgröße sank anschließend auf 2,8 Junge in der 50. Generation und 2,2 in der 55. Generation. Der letzte Wert lag etwa 79 % unter dem Kontrollwert, berechnet anhand von 2,2 gegenüber 10,3 Jungen.

Die Zahl der nach hormoneller Stimulation entnommenen Eizellen sank mit den fortschreitenden Klonierungsgenerationen nicht. Die Forschenden untersuchten daher, was nach der Aktivierung oder Befruchtung mit den Eizellen geschah.

Wurden Eizellen im Labor mit Spermien normaler Männchen befruchtet, erreichten 97,6 % der Kontrollembryonen das Blastozystenstadium, eine frühe Phase vor der Einnistung. Bei Eizellen von Klonen der 25. Generation waren es 39,7 %, bei Eizellen von Klonen der 53. Generation 20,3 %.

Versuche mit Eizellen der 56. Generation zeigten Probleme sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma, dem Material, das ihn umgibt. Der Austausch einer der beiden Komponenten gegen die entsprechende Komponente einer Kontrolleizelle führte weiterhin zu sehr niedrigen Entwicklungsraten. Beide Bestandteile der Eizelle schienen beeinträchtigt zu sein.

Geschlechtliche Fortpflanzung stellte einen Teil der Fruchtbarkeit wieder her

Einige Nachkommen von Klonen später Generationen überlebten und pflanzten sich erfolgreicher fort. Während geklonte Weibchen der 55. Generation durchschnittlich 2,2 Junge pro Wurf bekamen, lag der Durchschnitt bei ihren Nachkommen später bei 7,0 Jungen – mehr als dreimal so viel.

Auch die Plazenten dieser Nachkommen waren annähernd so groß wie die von Embryonen, die durch Befruchtung entstanden waren, und nicht so vergrößert wie bei geklonten Mäusen üblich.

Bei der geschlechtlichen Fortpflanzung wird das Erbmaterial bei der Bildung von Eizellen und Spermien neu verteilt und bei der Befruchtung mit DNA eines anderen Elternteils kombiniert. Eine funktionsfähige Genkopie eines Elternteils kann eine beschädigte Kopie des anderen mitunter ausgleichen. Embryonen mit schweren genetischen Problemen entwickeln sich möglicherweise nicht weiter, während solche mit einer tragfähigen Kombination überleben.

Die Nachkommen erbten weiterhin Mutationen von den geklonten Weibchen. Die Genomsequenzierung wies Varianten sowohl bei den Nachkommen als auch bei den Enkeln nach, darunter den Austausch zwischen den Chromosomen sieben und neun. Die Forschenden vermuteten, dass beide veränderten Chromosomen gemeinsam vererbt worden waren, sodass der Austausch ausgeglichen blieb.

Die größere Wurfgröße deutet somit auf eine teilweise Erholung der Fortpflanzungsfähigkeit durch geschlechtliche Fortpflanzung hin. Die Nachkommen konnten sich besser fortpflanzen und trugen dennoch weiterhin einige der während des Klonens angesammelten genetischen Veränderungen.

Bedeutung für Artenschutz und Landwirtschaft

Das Klonen interessiert den Artenschutz, weil sich genetisches Material aus eingelagerten Zellen von Tieren bewahren lässt, die bereits tot sind oder sich nicht fortpflanzen können. In der Landwirtschaft bietet es eine Möglichkeit, Tiere mit wertvollen Eigenschaften zu vermehren. Das Experiment zeigt, warum bei solchen Anwendungen der Zustand der Spender-DNA und die Fortpflanzungsfähigkeit der Nachkommen berücksichtigt werden müssen.

Die Ergebnisse betreffen wiederholtes Klonen über eine lange Kette aufeinanderfolgender Spender. 58 Generationen markieren das Ende dieser speziellen Mauslinie unter den untersuchten Versuchsbedingungen; wie viele Generationen bei anderen Linien oder Säugetierarten möglich sind, ist unbekannt.

Katarzyna Malin, Entwicklungsendokrinologin an der University of California, Davis, die nicht an der Forschung beteiligt war, sagte, die Ergebnisse sprächen für einen Artenschutz, der verhindert, dass Arten in eine Krise geraten, statt darauf zu setzen, sie anschließend mithilfe des Klonens zu retten.

Ben Novak von der Artenschutzorganisation Revive & Restore hob die Bedeutung von Mutationen hervor, die sich im Laufe des Lebens eines Tieres in dessen Körpergewebe ansammeln. Eine Spenderzelle bringt ihre eigene Geschichte an DNA-Veränderungen mit – ein wichtiger Aspekt, wenn sie zum Ausgangspunkt für ein weiteres Tier wird.

Die Studie vereint zwei praktische Erkenntnisse. Klonen kann den Zugang zum genetischen Material eines Tieres über viele Generationen erhalten. Gesunde Nachkommen hängen jedoch auch davon ab, was im Laufe der Zeit mit dieser DNA geschieht. In diesem Experiment ermöglichte die gewöhnliche Fortpflanzung einigen Nachkommen, ihre Fruchtbarkeit wiederzuerlangen, nachdem sich die Klonierungskette ihrem Ende genähert hatte.

Die wichtigsten Punkte

• Die Forschenden unternahmen 30.947 Kerntransfer-Versuche und erzeugten durch aufeinanderfolgendes Klonen mehr als 1.200 Mäuse ausgehend von einem einzigen Weibchen.
• Die Erfolgsrate bei den Geburten erreichte in der 26. Generation mit 15,5 % ihren Höchststand und sank gegen Ende des Experiments auf 0,6 %.
• Alle fünf Mäuse der 58. Generation starben am Tag nach ihrer Geburt. Damit endete die Kette im Jahr 2025.
• In der Klonierungslinie häuften sich pro Generation etwa dreimal so viele Veränderungen einzelner DNA-Bausteine an wie in den Vergleichslinien, die durch Verpaarung von Geschwistertieren weitergeführt wurden.
• Schädliche DNA-Mutationen und größere Chromosomenveränderungen häuften sich an, während sich die gemessenen epigenetischen Auffälligkeiten nicht zunehmend verschlimmerten.
• Geschlechtliche Fortpflanzung verbesserte bei einigen Nachkommen die Fruchtbarkeit, obwohl vererbte Mutationen bestehen blieben.